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【DNA甲基化】多组学数据原理与表观组学分析

点击次数:717 发布日期:2022/12/27 来源:华斯泰

第一节 高通量表观遗传组学数据原理

表观遗传调控的原理和概念

表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,即基因型未发生变化而表型却发生了改变。换言之,这是一种DNA序列外的遗传方式。基因组含有两类遗传信息:一类是传统意义上的遗传信息,即DNA序列所提供的遗传信息;另一类是表观遗传学信息,它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。

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现代研究发现,异常的表观遗传可能导致发生肿瘤、自身免疫病、衰老、神经精神异常和多种儿科综合征。

表观遗传学主要是对染色质重塑、DNA甲基化及组蛋白修饰、X染色体失活、非编码RNA调控等多方面进行研究。

对表观遗传中各种因子的突变导致疾病的研究,将有助我们了解表观遗传机制、基因表达和环境之间的关系,并期望能纠正或降低那些能够导致疾病的表观基因的不稳定性,指导疾病的诊治和新药的研制。

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与原核生物不同,真核细胞的基因组DNA在细胞核里是以染色质形式存在的。染色质是一个动态的多级包装的蛋白质―DNA复合物,染色质结构不仅对于巨大的DNA分子的包装起到重要作用,而且通过对其组分(组蛋白和DNA)的修饰来调节基因的表达。

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染色质是细胞间期真核生物基因组DNA存在的方式,它由蛋白质(分为组蛋白和非组蛋白)DNA和少量RNA组成。组蛋白有H1H2AH2BH3H4五种。DNA包装时,由各两个H2AH2BH3H4组成一个八聚体核小体,每个八聚体可缠绕146 bpDNA(称为核心DNA)H1联系相邻的核小体,有利于DNA更高级的包装。重复的核小体结构加上连接DNA,通过组蛋白及其他非组蛋白进一步地折叠、压缩形成高度有序的染色质结构。

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在细胞生命活动的选择性基因沉默或基因表达过程中,包裹于染色质中的基因组DNA序列一般不发生改变,但细胞核内的染色质结构可以发生高度动态变化,使一些特定基因组区域的转录活性呈现相应的改变。这种影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控,其分子基础有两个方面,即针对DNA本身的修饰和对组蛋白的修饰

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第二节 DNA甲基化数据分析方法

1. MassARRAY飞行时间质谱平台甲基化检测原理:

1.1 飞行时间质谱原理:

质谱仪简单来说就是把不同的分子按照分子量进行排序的仪器。

Maldi-Tof质谱,全称是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,不同分子量的分子飞行时间也不同,分子量越大飞行时间越长,根据飞行时间进而判断分子量大小。通过对物质的分子量进行检测,达到区分、鉴别物质的目的。

1.2 利用飞行时间质谱检测甲基化原理:

实验从亚硫酸盐处理待测DNA开始。经过亚硫酸盐处理DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),由此在DNA模板中产生了甲基化特异的序列变化。利用5末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增。产物经虾碱性磷酸酶(SAP)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化。配套软件EpiTYPER则能提供数字和图像注释工具,能将实验数据与客户提供的DNA序列相吻合。作为内在的质量控制机制,该系统还包括了基本统计学分析方法及数据可靠程度的评估手段,自动报告每个相应片段的甲基化程度。

2.Affymetrix芯片平台DNA甲基化检测原理:

首先使固相片基羟基化,并用光敏保护基团将其保护起来,然后选取适当的避光膜(mask)使需要聚合的部位透光,其他部位不透光。这样,当光通过避光膜照射到支持物上时,受光部位的羟基就会发生脱保护而活化,从而可以反应结合碱基。

3.其他DNA甲基化检测技术

3.1高效液相色谱 (HPLC)

3.2 甲基化敏感性限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)

3.3重亚硫酸盐测序法 (Bisulphite Sequencing)

3.4甲基化特异性的PCR (MS-PCR)

3.5TaqMan探针法

数据分析步骤

1.下载数据 GEO TCGA

2.整理数据

3.甲基化差异分析

4.功能分析

5.关联临床等

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