外泌体是由活细胞分泌的一种微小囊泡，其内包含有一些微小非编码RNA(如microRNA、lncRNA、circRNA等)，在细胞信号传导过程中起重要作用。它们通过循环小囊泡输送信息，调节肝癌细胞的上皮间质转化、肿瘤微环境、促进微小血管生成、调节肿瘤免疫、放化疗耐药以及调节细胞能量代谢途径等，促进肝癌的发生、发展以及转移。现就外泌体内长链外编码RNA与肝癌发生、发展以及转移的机制进行简要综述。

   原发性肝癌是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占原发性肝癌的90％[1]。长期以来血清甲胎蛋白仍是临床诊断HCC最常用的肿瘤标志物，但其灵敏度及特异度均不高。另外，α-L-岩藻糖苷酶[2]、肝细胞生长因子等也可用于HCC的诊断，但它们在诊断的特异度及敏感度方面还是令人不甚满意。因此，许多学者一直在努力探究以求发现新的肝癌标志物，从而提高肝癌早期检出率，实现早发现、早诊断、早治疗。

   外泌体是指直径在40～100 nm的微小囊泡[3]。其天然存在于各种体液中，内含蛋白质、脂质、mRNA、microRNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等，它可从供体细胞转移到受体细胞，调节细胞信号传导，如蛋白表达、细胞增殖、血管生成以及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等，在肝癌进展中发挥重要作用[4]。本文将对外泌体内源性lncRNA在肝脏疾病机制中的作用进行综述。

   多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。一般来说，外泌体通过三种方式作用于受体细胞[5]：(1)外泌体的跨膜蛋白与靶细胞的信号受体直接作用；(2)外泌体与受体细胞的质膜融合并传递其内容物到胞质中；(3)外泌体被受体细胞直接内吞或者通过吞噬作用被受体细胞摄取。

   外泌体可以运输功能性的lncRNA，lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA[6]。其序列可被剪切、带Poly-A尾、加帽，但是不具备编码蛋白的能力。研究发现，lncRNA在多种生命进程中起重要作用，包括基因调控、细胞周期监测、细胞迁移等[7]；同时也参与肝癌的发生发展。

   外泌体IncRNA与肝癌转移的相关机制

   1.调节血管生成：肝癌干细胞通过分泌外泌体激活Notch、Wnt/β-catenin、STAT3、PTEN、Hedgehog等信号通路，诱导血管生成，使其抵抗低氧环境[8]。而血管微环境又可以分泌生长因子经内分泌途径正反馈作用于肝癌干细胞，加速血管的形成，最终促进肿瘤细胞的增殖与侵袭性细胞表型的形成。

   研究发现，CD90+肿瘤干细胞与肝癌的转移和复发相关，CD90+肿瘤干细胞样肝细胞（CD90+Huh7）分泌的外泌体，可诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)血管生成，并使CD90+ Huh7和HUVECs发生黏附，其机制是CD90+Huh7能将lncRNA H19装载进外泌体，这种外泌体侵入内皮细胞后，将lncRNA H19传递至相应的结合部位，然后通过上调血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的合成和释放，刺激血管生成，并促进CD90+Huh7和内皮细胞的黏附[9]。进一步诱导lncRNA沉默后，VEGF蛋白表达水平显著下降，故外泌体可调控靶细胞相关mRNA的转录以促进血管生成，因此可能成为治疗靶点[10]。

   2.调节免疫系统活性：肿瘤的发生及转移与其所处的免疫状态紧密相关，而肿瘤微环境中的外泌体在此过程中扮演重要作用。肿瘤细胞来源的外泌体中携带的癌胚抗原和间皮素等肿瘤特异性抗原，通过树突细胞等抗原递呈细胞可以引起T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应[11]。外泌体源性lncRNA还可作为肿瘤细胞的信号分子，调控肿瘤免疫微环境，促进肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。

   肝癌高表达转录本（highly upregulated in liver cancer，HULC）是在肝癌组织中发现的一种特异性高表达的lncRNA[12]。Zhao等[13]研究结果表明，HULC在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝硬化组织中高表达，其能直接下调抑癌基因P18，增加调节性T淋巴细胞的数量，提高转化生长因子（transforming growth factor，TGF) β水平，促进肝纤维化免疫应答过程。

   3.促进抑癌基因失活：研究发现，假基因PDIA3P1（protein disulfide isomerase family A member 3 pseudogene 1）可能是HCC的一个致癌基因[14]。它是lncRNA的一个子集，由蛋白编码基因编码但是没有生成蛋白质的能力。PDIA3P1在HCC中通过抑制P53信号通路促进HCC细胞增殖和侵袭，并且能够抑制HCC细胞凋亡。

   Du等[15]研究证实了HULC基因涉及HBV X蛋白(HBx)介导的HCC发生，在HBV相关肝癌的癌组织中，HBx mRNA水平与HULC水平呈正相关，HBx可调节环磷腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）依赖性启动子的转录活性，间接活化HULC启动子以加强HULC基因转录；而过表达的HULC能够抑制邻近抑癌基因P18转录子的活性，在mRNA和蛋白质两个水平同时下调P18的表达，进而促进HCC细胞增殖。以上研究结果表明，靶向抑制HBx基因表达，从而减少HULC对抑癌基因活化的抑制作用，可能对HCC的治疗起到积极作用。

   4.EMT是指上皮细胞在形态学上转变为间质细胞，并获得远处转移的能力，其最显著的特征就是上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、角蛋白表达降低，以及间质标志物波形蛋白表达升高[16]。HCC细胞发生EMT后可突破基底膜，侵入血管和淋巴管实现侵袭和转移。

   lncRNA独立基因56159在HBV相关肝癌组织中高表达，它在体外由HBV诱导[17]。56159能够直接结合miR-140-5p,作为竞争内源性RNA使miR-140-5p减少，导致靶基因E-cadherin转录因子（SLUG）的表达下降。E-cadherin下调降低了细胞黏附的强度，引起细胞活动性增加，允许癌细胞穿过基底膜侵入周围组织，从而推动HCC的侵袭和EMT[18]。敲除56159基因后，可以明显地增加E-cadherin和角蛋白的表达，减少波形蛋白的表达，减少HCC细胞的侵袭。进一步说明56159可以促进肝癌细胞EMT、侵袭及转移。

    5.诱导放化疗耐受：外泌体内存在的lncRNA在化疗耐药性的传递中起着重要作用。研究发现，外泌体不仅可以诱导HCC细胞对化疗的耐药性，还可以增加HCC细胞对放疗的抵抗性[19]。通过干预外泌体源性lncRNA与受体细胞的作用，可以使肿瘤治疗更加高效。

       肝癌化疗耐药研究发现，1ncRNA在调节TGFβ依赖的化疗耐药中发挥着重要作用[20]。TGFβ降低了HCC对索拉菲尼的敏感性，使重编程相关长链非编码RNA（regulator of reprogramming，lncRNA-ROR)在肿瘤细胞及其分泌的外泌体中高表达，当这些高表达lncRNA-ROR的外泌体与受体细胞共培养后，发现化疗药物对受体细胞的杀伤作用减弱。

   6.竞争内源性RNA：在复杂的RNA调控网络中，ceRNA假说是一种重要的功能模式[21]。即某些转录本之间，如1ncRNA、环状RNA、假基因以及mRNA之间拥有共同的miRNA应答元件，通过竞争性结合miRNA，互为ceRNA，从而相互调节彼此功能。目前研究发现，这种体内ceRNA的相互模式，在个体生长发育以及肿瘤的相关机制中发挥重要作用。

   Wang等[22]研究发现，HULC具有miRNA"海绵"作用，在与miR-372相互作用下调其活性；miR-372的低表达则阻遏了自身对靶基因蛋白激酶A催化亚单位β的抑制，诱导环磷腺苷CREB的磷酸化；而磷酸化的CREB又可与HULC基因启动子内CREB结合位点特异性结合，维持HULC基因启动子内染色体结构的开放状态，使得HULC基因转录增加，并形成"正反馈调节"。后来，Wan等[23]研究表明，miR-203在肝癌组织中的表达水平较癌周组织下调，且与致癌基因HULC的表达呈负相关。上述研究提示了lncRNA HULC可作为ceRNA通过抑制miRNA的表达来促进自身水平的上调。

   此外，转录后调控也是lncRNA作为ceRNA参与HCC发生、发展相关基因调控的重要形式。如lncRNA尿路上皮癌相关基因1（lncRNA urothelial caicinoma associated 1，lncRNA UCA1）能够竞争性结合miR-216b，使成纤维细胞生长因子受体1的蛋白表达上调，并激活细胞外蛋白激酶信号通路，促进HCC的增殖与侵袭转移[24]。

   问题与展望

   目前的研究结果表明，无论是作为HCC标志物还是用于治疗，外泌体源性lncRNA都有很好的前景，但其也存在局限性。比如：（1）大量的外泌体源性lncRNA尚未被发现，它们的作用机制尚未被完全揭示；（2）外泌体源性lncRNA作为HCC标志物的特异度需要进一步提高；（3）细胞水平、动物实验以及大量临床数据均证实了较多表达失调的外泌体源性lncRNA，将这些lncRNA转化成为临床诊断手段的同时，也可能会带来意想不到的非特异性问题；（4）鉴于lncRNA作用靶点众多，不同的lncRNA可作用于相同的靶点，以至于完整揭示lncRNA调控网络显得较为困难；（5）虽然目前提取外泌体的方法很多，如：梯度离心法[27]、过滤离心法[28]、免疫磁珠法[29]、色谱法[30]等，但仍没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物学活性。

   近年来，随着基因芯片、高通量测序等方法的普及使用，将会为外泌体内源性lncRNA治疗肿瘤研究提供新的视野。相信随着对外泌体研究的不断深入，以上问题会逐一解决，最终会对人类HCC的治疗效果提供质的改进。